斑馬魚模型用于研究人類基因功能的一般策略
發(fā)布時間:
2018-12-06
斑馬魚模型用于研究人類基因功能的一般策略
作為優(yōu)選的模式脊椎動物，斑馬魚模型可以用來評價人類基因的作用與功能、解析其在遺傳與
發(fā)育上發(fā)揮作用的分子機制。如果候選基因與疾病高度相關，斑馬魚模型則可以用來幫助確認疾病
的致病基因，通過基因組改造（基因敲除、敲入和轉基因等）構建人類疾病的斑馬魚模型，表型模
擬人類疾病的病癥，進而用于研究分子遺傳病的病理機制、篩選治療疾病的化學藥、開發(fā)基因治療
的生物藥等生物醫(yī)藥的研發(fā)。
一、在斑馬魚胚胎中過表達目標基因（野生型vs 突變型等位基因）評價基因功能（暫時性）
如果目標基因在人類疾病中過表達，或者想了解突變基因可能的功能（包括功能缺失或功能獲
得），可以通過借助顯微注射技術在斑馬魚胚胎中過表達目標基因（野生型vs 突變型等位基因，
基本方法為：克隆人類目標基因、體外轉錄制備mRNA，將mRNA 顯微注入斑馬魚受精卵），將斑
馬魚胚胎當作一個體內(nèi)反應器，建立暫時性的體內(nèi)模型，從胚胎顯微行為學、顯微形態(tài)學、組織學、細胞生物學、轉錄組學等不同水平評價目標基因的功能及可能的作用機制。具體的評價策略需在對目標基因的個性化特征分析后確定。我們已有的工作積累表明，轉錄組分析是一種常用的比較有效的機制解析策略，通過選擇發(fā)育至合適時期的注射胚胎（需結合基因的特征進行評價后選擇），提取總RNA，進行轉錄組測序，從而有機會在轉錄組水平上無偏好地整體評價目標基因的功能（包括但不限于對特定生物學過程的影響、對特定信號通路的影響、對特定基因的可能調(diào)控作用）。基于上述研究目的時，即使待研究的人基因在斑馬魚中沒有同源基因，也可以根據(jù)已知目標基因的保守生物學功能（只要斑馬魚胚胎也存在類似的生物學過程），利用斑馬魚胚胎評價其功能。
二、在斑馬魚胚胎中敲降目標基因評價人同源基因功能（暫時性）
如果目標基因在斑馬魚基因組中有直系同源基因，那么就可以在斑馬魚胚胎中敲降目標基因，
評價人同源基因功能。如果選擇敲降目標基因的話，需要首先明確目標基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中有表達。如果目標基因在早期胚胎中沒有表達，毫無疑問敲降斑馬魚的同源基因，不可能獲得有用的信息。目標基因在斑馬魚上的早期表達，可通過RT-PCR 和胚胎整體原位雜交來檢測。RT-PCR 可以給出基因的發(fā)育時期特異性的表達模式（但缺乏組織特異性或空間特異性表達信息），而胚胎整體原位雜交則可以獲得時空特異性表達的全部信息。至于目標基因如果存在a 和b 兩個拷貝的情況，建議首先通過原位雜交確認那個拷貝的表達模式可能與感興趣的發(fā)育事件有關，如果胚胎整體原位雜交結果表明兩個基因均與可能與感興趣的發(fā)育事件有關，則需要同時敲降（一般安排敲降a、敲降b、敲降a+b 三組實驗）。在實踐工作中，還可能遇到斑馬魚的同源基因只是預測的結果，在這種情況下，需要首先克隆該基因（CDS 全序列）或至少該基因的部分CDS 序列（可借組于EST 序列信息）。在確定目標基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中有表達后，需要建立基因敲降的方法。斑馬魚基因敲降（knock down）策略為：1）使用兩個MO，其中一個與AUG 附近序列互補，抑制mRNA 翻譯，該MO 無需驗證有效性（活性），其是否具有活性只能通過敲降后的胚胎表型來確定；另一個與內(nèi)含子-外顯子連接處序列互補，抑制原始mRNA 的剪接，該MO 的有效性（活性）可以通過RT-PCR加以確認；而兩個MO 的特異性通常是通過設計相應的5-堿基錯配MO 作為對照來實現(xiàn)的；2）MO
加CRISPRi，其中的MO 為前述可抑制原始mRNA 的剪接的MO，CRISPRi 方法則是通過多個sgRNA
（一般建議4 個）引導dCas9 抑制目標基因的轉錄，從而實現(xiàn)目標基因的敲降；無論哪一種策略，
只有在兩種敲降方法得出的表型一致，且其異常表型可被mRNA 拯救的情況下，才可以被認定敲降
結果可靠。一般地，推薦使用策略2，因為策略2 中的兩種方法一個在轉錄后水平、一個在轉錄水
平（且一般認為CRIPSRi 的脫靶和毒性小于MO），因而結果的可信度更高。在確認了基因敲降的方法后，可以前述同樣的策略評價基因的功能及解析可能的分子機制。即：從胚胎顯微行為學、顯微形態(tài)學、組織學、細胞生物學、轉錄組學等不同水平評價目標基因的功能及可能的作用機制。具體的評價策略需在對目標基因的個性化特征分析后確定。我們已有的工作積累表明，轉錄組分析是一種常用的比較有效的機制解析策略，通過選擇發(fā)育至合適時期的注射胚胎（需結合基因的特征進行評價后選擇），提取總RNA，進行轉錄組測序，從而有機會在轉錄組水平上無偏好地整體評價目標基因的功能（包括但不限于對特定生物學過程的影響、對特定信號通路的影響、對特定基因的可能調(diào)控作用）。
三、構建基因敲除斑馬魚模型研究目標基因的功能（永久性）
如果期待通過功能缺失解析基因功能，那么構建基因敲除斑馬魚模型則是一種常見的選擇?；?/div>
因敲除的方法包括CRISPR/Cas9 或者TALEN，常用CRISPR/Cas9。功能研究方案同前。
四、構建轉基因斑馬魚模型研究目標基因的功能（永久性）
如果期待通過功能獲得解析基因功能，那么制備轉基因斑馬魚模型則是一種常見的選擇。轉基
因方法為Tol2 策略。功能研究方案同前。
五、構建基因敲入斑馬魚模型研究目標基因的功能（永久性）
人類分子遺傳病中很多是源于點突變或者小片段插入缺失造成的基因突變。在這種情況下，構
建基因敲入斑馬魚模型研究目標基因的功能是一種常見的選擇。要建立基因敲入模型，首先要進行
氨基酸水平上的保守性分析。只有氨基酸水平上是高度保守的，才可以考慮基因敲入（相對而言，
這種保守性在不少直系同源基因上并不好）。
另外，還需要特別提醒的是：目前斑馬魚的基因敲入技術非常不成熟，基因敲入的成本高且風
險極大。需要謹慎抉擇。（公司目前暫不接受一般客戶訂單，VIP 客戶在充分了解分析后，按共擔
成本的方法嘗試敲入項目）。功能研究方案同前。
南京堯順禹生物科技有限公司
2018-12-02
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