A:有脫靶機(jī)會，但通常識別活性會比較低，一般地，脫靶是需要盡量避免的。如果想要敲除兩個以上基因，需要針對要敲除的基因分別設(shè)計crispr以制備不同的sgRNA。 

2.

Q:crispr/Cas13在gRNA設(shè)計上有什么要注意的嗎？是否可以保留cas9所用的80bp骨架只更換gRNA？

A:Cas13的sgRNA與cas9的完全不同，不能使用cas9對應(yīng)的sgRNA骨架。

3.

Q:sgRNA的骨架與靶點CRISPR的結(jié)合緊密程度是否會影響打靶的效率？

A:sgRNA的骨架序列并不與crispr（基因組上的特定DNA序列）結(jié)合，識別crispr序列的是102nt（20+82 nt）sgRNA中的前20 nt（gRNA序列），通過gRNA與crispr序列的互補(bǔ)識別，sgRNA引導(dǎo)Cas9靶向切割crsipr中3'側(cè)（靠近PAM即NGG）的3至4 nt間的3‘-5’磷酸二酯鍵，形成雙鏈斷裂（DSB）。

4.

Q:請問我設(shè)計人基因的sgRNA的時候，發(fā)現(xiàn)保守結(jié)構(gòu)域所在的外顯子很少有比較高得分的，甚至說很低，請問這種情況應(yīng)該怎么辦?

A:crispr評分問題，綠色沒有問題，黃色勉強(qiáng)能用，紅色不能用（估計是在基因組中有相同序列，1個sgRNA將識別多于1個靶向位點，脫靶問題驗嚴(yán)重），實在為難的話，可crispr設(shè)計的區(qū)域提前到前一個外顯子。另外，建議使用CCTOP軟件設(shè)計crispr

Q:我們也在使用CCTOP這個軟件，但是發(fā)現(xiàn)有時排名靠前的卻評分為中等或低，不知道如何選擇。

A:評分的高低只是參考，medium應(yīng)該是不錯的。那個評分是來自一篇研究論文，如果閱讀原文，你會發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)的樣本量不是太大，且相關(guān)系數(shù)不是太大。所以效率評分僅作參考。選擇crispr時，不能在基因組中存在明顯的脫靶位置的序列。

Q:那么CCTOP選擇是優(yōu)先考慮排名是嗎？例如從T1-T2-T3...

A:還是優(yōu)選那些脫靶機(jī)會低的crispr，（看候選脫靶序列的相似性，盡可能選那些候選脫靶序列具3個mismatch的，然后在按效率的高低選。

 

5.

Q:如果做RT-PCR驗證，引物是不是需要特異性針對設(shè)計sgRNA對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本？

A:是的，需要將靶向突變位置的cDNA擴(kuò)增出來，注意，由于擔(dān)心基因組上基因組序列的改變可能會影響原始mRNA的剪接，因此，設(shè)計引物時，最好是在目標(biāo)序列的前面和后面的外顯子上分別設(shè)計正反向引物。

6.

Q:我做了一個CRISPR的基因敲除，目前在挑單克隆時送測了24個，亞克隆的情況多數(shù)出現(xiàn)兩組峰：一組是非移碼突變的，一組是有突變的（插入一個堿基或者突變成其它氨基酸），請問這種情況是我克隆沒挑夠還是基因本身的生理原因造成的??？

A:單克隆測序應(yīng)該不會出現(xiàn)“兩組峰”！你是將細(xì)胞克隆的基因組DNA的PCR產(chǎn)物直接送測序？還是將其亞克隆后再挑選陽性轉(zhuǎn)化子去測序的？如果是后者，你是否想說你的陽性轉(zhuǎn)化子克隆測序結(jié)果表明：一組（若干個克?。榉且拼a突變，一組（24個克隆中的另外一些克隆）是有突變的（插入一個堿基）？

Q:是的，是亞克隆測序，一組為非移碼突變，一組為突變。我送了十個單克隆出去測TA都是這個樣子，我想說，能不能把之前的sgRNA的病毒再感染一下這些單克隆，可否拿到雙槍的結(jié)果？

A:?你首先需要確認(rèn)原先的sgRNA識別的序列在候選細(xì)胞克隆的基因組序列中是否已被突變？如果已經(jīng)突變了，則sgRNA無法再次發(fā)揮左右（一般地，如果已經(jīng)發(fā)生突變即使是非移碼突變，其crispr序列應(yīng)該已經(jīng)突變）。

7.

Q:我想請問下sgRNA設(shè)計中，有些網(wǎng)站把PAM序列也弄到sgRNA里了，有些網(wǎng)站又沒有，那我們設(shè)計sgRNA的時候需要把PAM也加進(jìn)去嗎？

A:常用CRISPR設(shè)計軟件

1、http://crispr.mit.edu

2、http://crispr.cos.uniheidelberg.de/index.html

3、http://crispor.tefor.net/

4、http://www.rgenome.net/cas-designer/

5、http://zifit.partners.org/ZiFiT/

這里需要區(qū)別兩個名詞：CRISPR vs sgRNA；一些文獻(xiàn)常將這兩個詞混用（我們最初的培訓(xùn)講義也是混用的）。實際上，sgRNA是RNA形式的分子。在基因組編輯中，sgRNA引導(dǎo)Cas9靶向識別CRISPR序列，其中的PAM（CRISPR序列臨近的3個核苷酸NGG為PAM）作為CRISPR序列在基因組上的一個標(biāo)記，對于靶向識別至關(guān)重要，靶向識別的結(jié)果是Cas9的兩個核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域(兩把”分子剪刀“)將PAM前的3-4核苷酸間的3'-5’磷酸二酯鍵切斷，造成DSB（雙鏈斷裂）。DSB出現(xiàn)后，誘發(fā)細(xì)胞針對該DSB進(jìn)行NHEJ或HR修復(fù)，產(chǎn)生不同編輯子。篩選不同的編輯子，有希望獲得KO或KI的等位基因。從上述描述可以看出，CRISPR序列是一個DNA序列（不包括PAM），而由此合成的sgRNA則是用來識別該DNA序列的。張鋒把CRISPR + PAM 序列稱作Guide 序列，我們在講課中使用這一說法。在使用軟件設(shè)計CRISPR序列時，需要將目標(biāo)DNA序列（包括假定的PAM序列）都輸入，如果沒有PAM，就不可能設(shè)計出CRISPR序列。

Q:那還有一個問題老師，我想請問下軟件里設(shè)計的sgRNA會不會有的是反義鏈上的序列呢，如果有的話我們需要把它互補(bǔ)配對回來再加CACC(g)嗎？是否只需要直接在給出的序列前面加CACC（g)就行？

A:加什么序列取決于你使用的驅(qū)動sgRNA表達(dá)的空載體中啟動子的序列，CACC應(yīng)該是人U6啟動子的最后4個核苷酸序列。

 

8.

Q:用T7啟動子資料說轉(zhuǎn)錄起始位點是G或A ，但是ZiFiT網(wǎng)站是GG，是不是三個都可以，要是20個核苷酸的CRISPR序列首位不是這三個G, A或者GG, 自己手動添加到里面是不是也可以？

A:CRISPR序列一般以G開頭，這是由于轉(zhuǎn)錄自嘌呤（主要是G，有時為A)開始（是為轉(zhuǎn)錄起始位點）。如果crispr（20nt）序列的前2 nt是GG，在以T7啟動子（前17 nt)為驅(qū)動的體外轉(zhuǎn)錄中，當(dāng)然是最好，如果crispr（20 nt)不是以G開頭，可以加1-2個G（一般加1個G即可），多了1-2G的sgRNA被證明不影響引導(dǎo)常用Cas9（spCas9）識別crispr序列的活性，但不能有效引導(dǎo)espCas9（保真版Cas9）識別crispr序列。

9.

Q:如果U6啟動子啟動轉(zhuǎn)錄多了一部分序列會對sgRNA的轉(zhuǎn)錄及效率產(chǎn)生影響嗎？就是：U6+一小段序列+BbsI-sgRNA-BbsI這樣的設(shè)計，這一小段序列對整個結(jié)構(gòu)的影響很大嗎？

A:轉(zhuǎn)錄本身可能沒有什么問題，但轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不是你原來設(shè)計的sgRNA。最近有報道說多出來幾個nt可能對引導(dǎo)spCas9識別crispr序列影響不大，但是你提出的這種設(shè)計方式顯然不是推薦的方式，其結(jié)果是很可能不能獲得你期待的基因組編輯作用?。

Q:看測序結(jié)果的時候我們應(yīng)該看哪里，理想中的是在設(shè)計的三個sgRNA的位點出突變嗎？還是在某個sgRNA附近突變也可以。

A:DSB一般出現(xiàn)在PAM前的3-4bp之間。NHEJ修復(fù)在此發(fā)生，因此，Indel突變（插入缺失突變）主要發(fā)生在位置的附近，當(dāng)然也會有較大（甚至更大）片段刪除的情況出現(xiàn)。每個crispr位置都可能出現(xiàn)突變（如果對應(yīng)的sgRNA都有活性的話）。但當(dāng)有活性的sgRNA同時出現(xiàn)時，造成大片段刪除的機(jī)會大增。在這種情況下，常常仍能發(fā)現(xiàn)indel突變發(fā)生在每個crispr位置上的痕跡（即突變主要出現(xiàn)在PAM前的3-4bp附近）。

10.

Q:一個基因上如果我同時對2個sgRNA位點進(jìn)行編輯,這兩個sgRNA距離多遠(yuǎn)合適？是最好在同一個外顯子上嗎？

A:你的目的是希望敲除這個基因，還是希望制造出兩個Indel突變位點？如果是前者，我們建議二者之間的距離不要超過 200 bp (越近越好）。如果是后者，則建議相距200 bp之外，越遠(yuǎn)越好。

 

 

 

 

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